篇一：过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定
傅璐121140012
一、 实验目的
1. 了解米氏常数的测定方法
2. 学习提取生物组织中的酶
二、 实验原理
1. 米氏反应动力学
米氏方程
(Michaelis-Menten Equation):
2. 米氏常数的意义：
① 反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、
底物浓度无关。
② 米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。其数值大
小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。
③ Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物
就是该酶的最适底物。
3.米氏常数的求法：
该作图法应用最广。但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较
集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。
此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。[S]<<Km时图形近于水平线，[S]>>Km时直线将在原点附近与轴相交。
4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基： ①POD：过氧化物酶
②SOD:超氧化物歧化酶
③CAT：；过氧化氢酶
5.过氧化氢酶的作用：
植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。
6.过氧化氢酶活力的测定方法：
①紫外吸收法：
过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。（以一分钟内A240nm下降0.1为一个单位）
②滴定法（高锰酸钾法、碘量法）
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。根据单位时间内消耗的过氧化氢的量即可测出过氧化氢酶活力大小。
7.实验中的反应 ：
H2O2被过氧化氢酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性环境中滴定, 根据反应前后的浓度差可以算出反应速度:
酶
2H2O2 ?→ 2H2O + O2
2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 ?→ 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2
（本实验以马铃薯提供过氧化氢酶）
三、 实验试剂
1. 0.02mol/L 磷酸缓冲溶液 (pH=7.0): 实验室提供.
2. 酶液: 称取马铃薯 5g, 加缓冲液 10mL, 匀浆过滤.
3. 0.01mol/L 高锰酸钾.
4. 0.098mol/L H2O2.
5. 25%H2SO4.
四、 实验操作
取 6 只锥形瓶, 按下表的顺序加入试剂.
先加好过氧化氢和蒸馏水, 加酶液后立即混合, 依次记录各瓶的起始反应时间. 反映到达 5min 立即加入2ml 25%硫酸终止反应, 充分混匀.。用 0.01mol/L 的 KMnO4溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色, 记录消耗的高锰酸钾体积.。
五、注意事项：
1.反应时间必须准确。
2.酶浓度须均一，若酶活力过大，应适当稀释。
3.滴定终点的判定。
六、实验结果：
过氧化氢浓度：0.098mol/L
称取马铃薯的质量：5.00g
米氏常数Km= -0.1913
七、实验结果分析：
1.曲线上少一个点的原因：
用移液管移取序号为2的过氧化氢溶液（应为1.25ml）错误的移取了1.75ml，故在制图时将其舍去。
2.曲线线性较好（R2=0.9988）的原因：
本实验采取了两人分工的方法完成实验，控制反应结束及滴定分别由一人完成，所以标准都相同，从而在一定程度上提高了实验的准确性。
3. Km计算结果呈负值的原因：
Km呈负值（即整条直线都向下移动），亦即所有测定的v值都偏大。
由v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5，故推断最可能的原因是V2整体测量偏小，可能的操作失误是编号为0的空白对照组中高锰酸钾的滴加量偏高，从而使除去该点的整体的高锰酸钾量都偏小。
篇二：过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定
一、 实验目的
了解并掌握米氏常数的意义和测定方法 二、 实验原理
H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMnO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
2H2O2 = 2H2O + O2
2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 =2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 ↑ + 8H2O 本实验由马铃薯提供过氧化氢酶。在保持恒定的条件下，用相同浓度的过氧化氢酶催化不同浓度的H2O2分解。在一定限度内，酶促反应速度与H2O2浓度成正比。用双倒数作图法(即以1/v对1/[S]作图)可求得过氧化氢酶的Km值。 三、 实验器材
锥形瓶(6个)吸管、酸式滴定管 四、 实验试剂
1、0.02mol/L 磷酸缓冲液(pH=7)2、0.004 mol/L KMnO4(需标定) 3、0.05 mol/L H2O2(需标定) 4、25% H2SO4 五、实验操作
1、酶液的提取：称取马铃薯（去皮）5克，加0.02mol/L 磷酸缓冲液10mL，再加少量海砂，研磨成匀浆，离心(3000r/ min，10min)，上清液即为酶液。 2、滴定：取干燥锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：
先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0mL 25% H2SO4终止反应，充分混匀。用0.004 mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。 六、实验计算
分别求出1─5瓶的底物浓度[S]和相应的反应速度v 。
C1V1
10
[S]= 5 ∕2C2V2
C1V1–
v =
式中[S]：为底物物质的量浓度(mol/L) C1：为H2O2物质的的量浓度(mol/L)
V1：为H2O2的体积(mL)10：反应的总体积v ：反应速度(mmol/min)C2: KMnO4物质的量浓度(mol/L)V2：KMnO4的体积(mL)
以1/ v对1/[S]作图求出Km。 七、实验注意事项
( 1 ) 按表先加H2O2及蒸馏水。
( 2 ) 准确控制各瓶中酶促反应时间尽量一致。 ( 3 ) 各种试剂的加量应准确。
篇三：实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 (1)
幻灯片1
实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定
——高锰酸钾滴定法
幻灯片2
一、实验目的
? 1.掌握过氧化氢酶活力测定的方法
? 2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理 ? 3.掌握测定酶米氏常数的基本原理和方法
幻灯片3
二、实验原理
? 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，
铁起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。 ? R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－)
? R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2
? 总反应式：2 H2O2 2H2O+O2
过氧化氢酶
幻灯片4
? 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
? 本次实验酶促反应速度用单位时间底物的减少量表示，求出单位时间内反应前后H2O2
的量，计算出酶促反应速度。
? 在反应系统中加入过量的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条
件下）滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
? 5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4 =5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
幻灯片5
底物浓度对酶促反应速度的影响
? 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。
? 底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加迅速增加；随着底物浓度继
续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到一定值时，反应速度达到极限值（Vmax）。
? 米氏方程表示底物浓度 与反应速度的关系
幻灯片6 米氏常数Km
? Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。
? 在酶学分析中， Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。
? Km表示酶和底物之间的亲和能力， Km值越大，亲和能力越弱，反之亦然。
? 对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。
问题：如何测定酶的Km值?
幻灯片7
? 米氏方程的倒数形式，即双倒数作图法 ? （LineweaveR-Burk法）如下：
? [S]为底物浓度（mol/L） ? v为反应速度（μ
mol/L*min）
? vmax为最大反应速度（μ
mol/L*min）
? Km为米氏常数（mol/L）
? 用双倒数法（以1/v对1/[S]作图） 计算Km和vmax
Km11??vvmax[S]vmax
幻灯片8
三、材料、试剂与器具 1.材料：新鲜马铃薯 2.试剂：
1）10% H2SO4
2）0.2mol/L磷酸缓冲液,pH7.8
3）0.02mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，临用前用草酸钠标定。 幻灯片9
高锰酸钾溶液标定
?取5mL 0.1mol/L的草酸和3mL 10% H2SO4溶液于锥形瓶中，加热至（75～85）℃
（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。
? 离子反应方程式：2MnO4-+5C2O42-+16H+←→2Mn 2++10CO2+ 8H20 计算公式：标定的 KMnO4 C=0.2/V mol/L 幻灯片10
4）0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68mL，稀释至1000mL，用标准0.02 mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。
5）0.1mol/L草酸钠：称取优级纯Na2C2O4 13.4g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
幻灯片11 3.器具
（1）恒温水浴
（2）研钵
三角瓶（50mL×4） 酸式滴定管（10mL） 容量瓶（50mL） 幻灯片12 四、实验步骤
? （一）酶液提取
取新鲜马铃薯5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至50mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
注意：提酶在0－4℃操作
幻灯片13
? （二）酶活力的测定 ? 1.反应
? 取50mL三角瓶4个（两个测定＋两个对照），测定瓶中加入酶液2.5mL，对照瓶中加
入煮死酶液2.5mL，再加入2.5mL 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5mL。
? 2.滴定
用0.02mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30s内不消失）为终点。
注意：每瓶反应时间要精确控制在10min
幻灯片14 3.计算
? 酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示 ? 酶活(mgH2O2/g·min)= ? 式中：
? A—对照KMnO4滴定毫升数；
? B—酶反应后KMnO4滴定毫升数； ? VT—酶液总量（mL）；
? V1—反应所用酶液量（mL）； ? F W—样品鲜重（g）；
1.7—1mL 0.02mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2
幻灯片15
（三）动力学常数的测定（ Km和vmax） 1.反应
? 取100mL锥形瓶5个，编号后按下表加入试剂
? 各瓶分别加好H2O2和蒸馏水后，再依次加入酶液0.5mL，混匀，记录各瓶起始反应的
时间。30℃反应5min后立即加入10% H2SO4 5.0mL终止反应。
(A?B)?VT?17.FW?V1?t
? ? ? ?
幻灯片16 2.滴定
? 用0.02mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4溶液毫升数。
分别求出各瓶反应前后的底物浓度[S]0、[S]1，并计算反应速度v：
[S]0=C1V1/10[S]1=2.5C2V2/10v=(C1V1-2.5C2V2)/5
? 以1/v对1/[S] 0作图 ? 求出Km和Vmax
（用excel作图）
3.计算
[S]0为反应前的底物浓度（mol/L） [S]1为反应后的底物浓度（mol/L）
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