篇一：分子生物学实验思考题答案
分子生物学实验思考题答案
实验一、基因组DNA的提取 1、为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA?
答、文库的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体克隆尽量大的DNA片段.
2、如何检测和保证DNA的质量？
答、用凝胶电泳看，有没有质白质和RNA等物质的污染，还可以测OD，用OD260/280来判断， 当OD260/OD280< 1.8，表示蛋白质含量较高 当OD260/OD280> 2.0，表示RNA含量较高 当OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA较纯。
实验二、植物总RNA的提取
1、RNA酶的变性和失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？
答、有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提取中用PEPC,Trizol
2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。
答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mRNA从总RNA中分离出来
实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？
答、A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。
C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，
D） 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
2、感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领域？
答、在基因工程中将质粒导入受体细胞是如果受体细胞是细菌则将它用Ca2+处理变为感受态细胞质粒进入。
实验五、质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定
1、在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入抗生素？
答、活化培养用的一般是SOC培养基，这种培养基比LB培养基营养，此时进行的活化培养只是为了让大肠杆菌迅速复苏，恢复分裂活性，此时的细胞还不具抗性，加入抗生素会细胞会死亡。
2、什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几种类型？用于基因重组的主要用到哪些质粒？ 24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
答、质粒是细菌体内的环状DNA分子。
质粒也是作为细菌遗传载体的一部分，但通常其携带的基因对细菌而言必要性要比核内DNA的小很多。比如，抗性基因，荧光蛋白基因等等。
根据质粒随细胞分裂而分裂的次数，将其分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
常用于基因重组的质粒是pBR322质粒，因为其基因测序已经完成，而且它携带了两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因Apr，另一个是四环素抗性基因Tetr。
实验六、质粒DNA的分离纯化和鉴定
1、在实验过程中，加入的EDTA、SDS分别起什么作用?
答、EDTA可以结合DNA酶等，可以抑制其活性；SDS主要是裂解细菌和沉淀蛋白。
2、乙酸钾在实验过程中主要起什么作用?
答、主要是在分离过程中起着中和PH的作用，DNA经碱（NaoH)裂解后，染色体DNA氢键断裂，双螺旋解开，质粒DNA氢键断裂，互补链不能完全分离，再经乙酸钾中和成中性后则复性离心就可以达到分离的效果。
3、氯仿在核酸的提取过程中有何作用？
答、克服酚的特点，加速有机层和液相的分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中迹量酚。
4、本实验整个过程中应该注意些什么？
答、1、提取过程应尽量保持低温；
2、提取质粒DNA过程中除去蛋白质很重要，采用酚、氯仿去除蛋白质要比单独用酚或者氯仿要好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
3、沉淀DNA一般使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可以使沉淀完全。沉淀DNA也可以使用异丙醇（一般使用等体积),且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀，所以多数还是用乙醇。
实验七、聚合酶链式反应——一般原理和技术
1、降低退火温度对反应有何影响？
答、变性所需的加热温度取决于模板及 PCR 产物双链 DNA 中的 G+C 含量。 双链 DNA 中的 G+C 的比率越高，则双链 DNA 分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与 DNA 分子的长度 相关，DNA 分子越长，在特定的变性温度下使双链 DNA 分子完全分离所需的时间就越长。 若变性温度太低或变性时间太短，则只能使 DNA 模板中富含 AT 的区域产生变性，当 PCR 循环中的反应温度降低时，部分变性的 DNA 模板又重新结合成双链 DNA，从而导致 PCR 的失败。非特异性条带数增多。
2、PCR 循环次数是否越多越好？为何?
答、循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
3、PCR技术可应用与哪些方面？举例。
答、1、核酸的基础研究：基因组克隆
2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序
3、反向PCR测定未知DNA区域
4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA
5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控
6、cDNA末端快速扩增技术
7、检测基因的表达
8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学
实验八、DNA的限制性内切酶酶切和鉴定
1、写出ECORI和Hind3两种内切酶消化产物的末端序列。
答、G^AATTC EcoRI的识别序列和切割位点，粘性末端即：AATTC- CTTAA^G G- HindⅢ的识别序列为：A^AGCTT “^”为切割位点，黏性末端为：AGCTT- A-
2、什么是粘性末端和平末端？
答、用限制酶切割后得到的末端齐平就是平末端，一长一短就是粘性末端
3、限制性内切酶在基因工程中有什么作用？
答、用同种限制酶对含目的基因的DNA分子和运载体（如：质粒）进行切割，产生同种黏性末端（核苷酸序列），从而进行重组（加DNA连接酶），以导入目的基因。
篇二：华师分子生物学实验考试答案整理
一、名词解释：
1、 聚合酶链式反应
是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。
2、 质粒
存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
3、 星号活性
在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种"星号"活性可能是内切酶的一种普遍特性
（1）如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。
4、 限制性内切酶
可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内 切酶，简称限制酶。
5、 转化
是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。该现象首先发现于细菌。
6、 转化子
受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象转化后的受体菌，称转化子transformant
7、 重组子
两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。
重组子（recombinant)另一定义是指， 含有重组DNA分子的转化细胞。
8、 感受态细胞
细胞经过一些特殊方法（电击法、 CaCl2法、 RbCl(KCl等化学试剂法)的处
理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞(Component cells)。
二、深刻理解和掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理，以及溶液I、溶液II和溶液III的主要成分及其在实验中所起的作用。为何出现较多的RNA污染，如何解决RNA污染的问题？
（碱裂解可以利用变性和复性的差异较有效地区分质粒和较大的DNA（如基因组DNA），但是不能区分同样是较小分子的RNA和质粒DNA，因为两者虽然有单链和双链的区别，RNA内部可形成二级结构，但是他们的分子量差异不大，变性和复性行为上没有差异。 加入RNA酶可水解RNA污染。） ? 基本原理
质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后，溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）Tris·HCl（ 25mmol/L， pH8.0）EDTA （10mmol/L） 溶液Ⅱ：NaOH （0.2mol/L） ；SDS （ 1%，新鲜配制，常温保存） 溶液Ⅲ： 60ml 5mol/L KAC ； 11.5ml的冰醋酸； 28.5ml水
溶液I低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。EDTA的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris?Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。
SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH(pH>12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。
KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使DNA复性。K+会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。
三、如何判断DNA酶切是否完全？若没有完全酶切，应如何改进实验。
取未酶切处理和酶切处理的DNA样在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，与未酶切DNA电泳条带相比，酶切处理的DNA样品电泳速度较慢，条带滞后，则已完全酶切；若条带与未酶切处理条带一致，则完全没有酶切效果；若同时出现这样的两条带，则不完全酶切；
实验改进：影响酶切的因素：DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等 可通过增加限制酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切
四、深刻理解和掌握蓝白斑筛选阳性重组子的原理。
蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基
端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
五、深刻理解和掌握重组DNA分子的基本流程 （包括PCR扩增目的片段→提取质粒载体DNA→选择适当的限制内切酶对目的片段和质粒载体进行酶切→目的片段与载体连接 → 转换大肠杆菌→ 进行阳性转化子和重组子的筛选）。详细说明涉及到的分子实验并给出简略的实验步骤。
PCR
质粒DNA的提取、酶切与连接
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
受体菌的培养→ 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) →质粒pUC19的转化
→涂布平板筛选转化质粒→ 次日（12-14小时后）观察和计算转化率 ：观察记录转化情况并统计转化率。
六、琼脂糖凝胶电泳主要依据分子筛效应来区分不同分子量以及不同构型的DNA。质粒DNA有三种不同的构型，分别为超螺旋、环形和线形DNA。通常情况下超螺旋质粒DNA迁移率最快，线型和环形迁移率相对较慢。下图为质粒DNA单酶切电泳图，其中泳道1和2分别代表未酶切的质粒DNA和酶切后的质粒DNA。三块凝胶的浓度不同，分别为0.5%，1.5%和2.0%。请对3种不同的电泳结果进行分析，并解释这些结果说明了什么？为什么会出现这样的电泳结果？
篇三：聚合酶链式反应精选习题
一、PCR扩增的原理及条件
1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。
2．原理
(1)DNA的热变性：在80～100 ℃的温度范围内，DNA_________结构解体，双链分开，这个过程称为_____。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。
(2)子链的合成：①需要______；②合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
3．条件
(1)______模板。
(2)分别与模板DNA两条链相结合的两种引物。
(3)A、T、G、C四种______________。
(4)耐热的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶。
(5)需要稳定的_____和能严格控制_____的温控设备.
二、PCR反应过程
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为____、复性和延伸三步。
1．变性：当温度上升到______以上时，双链DNA解聚为单链。
2．复性：温度下降到_______左右，两种引物通过________________与两条单链DNA结合。
3．延伸：温度上升到_____左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在_______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
三、实验操作
1．实验用具
(1)PCR仪：该仪器能自动调控_____，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个___________代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
(2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行离心的场所。
(3)微量移液器：用于吸取转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更换。
2．操作步骤
准备→____→混合→_____→反应。
四、操作提示
1．为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行__________。
2．所用的_________和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。
五、DNA含量的测定
1．原理：利用DNA在260 nm的紫外线波段的______曲线来测定相应含量。
2．计算公式：DNA含量(μg)＝50×(260 nm的读数)×_____________。
3．生物体内DNA复制与PCR反应的区别
PCR反应的实验操作过程
若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替，三个恒温水浴锅的温度分别为94 ℃、55 ℃和72 ℃，
然后按照上表要求，在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
(2)微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为0.5 mL。
(3)微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。
3．实验操作步骤
按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放在实验桌上；用微量移液器按照配方在微量试管中依次加入各组分；盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁；将微量离心管放在离心机上，离心约10 min；将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序
1、下列关于DNA复制和PCR的描述中，正确的是( )
A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链
B．DNA复制不需要引物
C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D．PCR扩增的对象是氨基酸序列
2、关于DNA片段PCR扩增实验的描述中不正确的是( )
A．加入的Taq DNA聚合酶耐高温
B．不同大小DNA在电场中迁移速率不同
C．此过程需要DNA连接酶
D．扩增区域由两种引物来决定
3、某个DNA样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A∶G∶T∶C＝1∶2∶3∶4，则经过PCR仪五次循环后，将产生________个DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是________个。
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