篇一：细胞染色示踪方法
DAPI和BrdU等染料标记细胞都存在随细胞分裂荧光减弱的现象，荧光染料标记的方法，有一个难以克服的问题：细胞在受体内存活难以证明，因为这些经过荧光染料标记的细胞被巨噬细胞吞噬后，细胞碎片在巨噬细胞内也可以有荧光表达，有时也会导致细胞周围的其他细胞出现假阳性。所以，仅使用这样的标记方法是很难在国际杂志发表论文的。 比较可信的标记方法是Y染色体和转基因标记，最理想的办法是GFP基因转染。这些标记的方法不仅可以显示细胞的存活情况，还能够准确的显示细胞的定位。同时由于是表达型的标记方法，所以不存在减弱的现象和丢失的现象，也不存在假阳性的问题，所以是一种准确的细胞标记方法。
GFP标记方法稳定，容易检测，结果权威，被国际上的科学家广泛认可.
标记方法有：
1、遗传性地改变细胞的基因，表达标志物
（1）绿色荧光蛋白（GFP）或者红色荧光蛋白（RFP）报告基因的转染。
这是目前鉴定移植细胞最常用的方法。将携带有GFP或者RFP基因的质粒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体转染待移植的细胞，通过荧光检测受体组织中的GFP或者RFP，可以对移植的细胞进行定性和定位观察。是目前最权威的一种标记方法之一。
（2） β半乳糖苷酶（β-Gal、LacZ）基因转染细胞标记技术。
这也是目前鉴定移植细胞常用的方法。
2.选用雄性供体和雌性宿主，利用Y染色体作为标志物
染色体组成是雄杂合型(XY型)：雌性个体性染色体组成为XX,雄性个体性染色体组成为XY。移植后，通过检测雌性宿主不同组织中的Y染色体出现的情况，来判定外源性的细胞在宿主体内的分布。
3.利用染料标记细胞
DAPI：4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好U（紫外光）的激发波长正好是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。
BrdU：BrdU和DAPI同属于DNA结合型荧光染料，BrdU会随着细胞分裂而不断被“稀释”，以至于最终完全不能检出。因而不适合做长时期的体内标记追踪。BrdU标记法的基本原理是利用溴化脱氧尿嘧啶（BrdU）作为胸苷类似物可以掺入到新增殖细胞合成DNA中的特点。
DiI：1，1’二（十八烷基）-3，3'，3'，3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐（1,1'-dioctadecy1-3,3,3'，3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI）是一种亲脂性碳花青染料，容易嵌进生物质膜内并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞。荧光染料DiI被认为以类似于磷脂的方式与脂蛋白结合，最初用于荧光显微镜下观察细胞结合或内吞脂蛋白，并能进行半定量分析。
用有机溶剂提取细胞膜受体结合的DiI标记的脂蛋白或用Na0H—SDS裂解细胞后直接进行荧光分析，可以定量检测脂蛋白受体活性，这一方法被广泛用于脂蛋白受体结构与功能关系的研究。
篇二：细胞示踪荧光探针的基础知识概述
细胞荧光探针北欧广泛应用于测定细胞总量、干细胞体外实验、追踪活细胞行踪，细胞荧光探针有许多种，由于篇幅原因这就主要介绍以下三种：细胞增殖示踪荧光探针CFDA SE、活细胞荧光示踪探针VFSE 450、DiI(细胞膜红色荧光探针)。
细胞增殖示踪荧光探针CFDA SE
CFDA SE的全称为Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，是一种近年来被广泛应用的细胞增殖检测用荧光探针，也可以用于细胞的荧光示踪。
基于CFDA SE荧光标记的细胞增殖检测和[3H]-thymidine掺入、BrdU标记获得的检测结果完全一致，但同时可以提供更多的细胞增殖信息。使用CFDA SE检测可以提供整个细胞群中有多少比例的细胞分裂了1次、2次或更多次数，同时如果和其它荧光探针联用，可以获取不同分裂次数细胞的其它相关信息。
CFDA-SE的分子式为C29H19NO11，分子量为557.47，CAS number为150347-59-4。CFDA SE可以通透细胞膜，进入细胞后可以被细胞内的酯酶(esterase)催化分解成CFSE，CFSE可以偶发性地(spontaneously)并不可逆地和细胞内蛋白的Lysine残基或其它氨基发生结合反应，并标记这些蛋白。在加入荧光探针CFDA SE后大约24小时，即可充分标记细胞。被CFDA SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数个月。CFDA SE标记细胞的荧光非常均一，比以前使用的其它细胞示踪荧光探针例如PKH26的荧光更加均一，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均匀。
由于CFDA SE标记细胞的荧光非常均匀和稳定，每分裂一次子代细胞的荧光会减弱一半，这样通过流式细胞仪检测就可以检测出没有分裂的细胞，分裂一次的细胞(1/2的荧光强度)，分离两次的细胞(1/4的荧光强度)，分裂三次的细胞(1/8的荧光强度)以及类似的其它分裂次数的细胞。采用CFDA SE通过流式细胞仪检测获得的检测结果参考右图。每一个峰代表一种分裂次数的细胞，从右至左的峰通常依次为分裂0次、1次、2次、3次等次数的细胞。分裂次数较多后，分裂0次或1次等没有分裂或分裂次数较少的细胞会逐渐减少直至检测不到。
使用CFDA SE可以检测分裂多达8次或更多次数的细胞增殖。
目前CFDA SE标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞增殖检测。最常用于淋巴细胞的增殖检测，也可以用于成纤维细胞、NK细胞等其它细胞的增殖检测，甚至还可以用于细菌增殖的检测。
CFDA SE标记细胞呈绿色荧光，检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为518nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。CFDA SE标记的细胞也可以用荧光显微镜进行观察。
CFDA SE标记的细胞无论在体外还是体内都不会使邻近细胞染色。即CFDA SE荧光探针完成标记后不会从一个细胞转移到邻近细胞。
CFDA SE标记细胞仅需5-15分钟即可完成。对于不同细胞，最佳标记时间需自行摸索。
CFDA SE可以使用无水(anhydrous )配制，配制浓度通常为2-10mM。配制好的溶液宜当天使用完毕，不宜长时间保存。CFDA SE标记细胞时的最终浓度通常为0.2-10μM或更高一些。
在工作浓度为5μM时，一个包装的本产品共可以标记约1.8升的细胞。
活细胞荧光示踪探针VFSE 450
荧光标记细胞已被广泛证实可有效确定总细胞的数量和一个样本中存在多少活细胞。流式细胞术结合荧光染色法是分析非均质细胞种群的有力工具。非荧光性的FDA和它的衍生物分子进入细胞后被胞内无特异性的酯酶所水解产生荧光。这些荧光产物只能积聚在具有完整细胞膜的细胞中。因此，死细胞无完整细胞膜不能被染色。FDA及其类似物(如CDCFDA)精细的跨膜动力学以及胞内水解特点与细胞功能相关，因此FDA标记可以通过荧光显微镜或者流式细胞仪来检测细胞。然而，因为CFSE和它的荧光类似物与GFP或者FITC具有相同的激发光谱，因此CFSE和它的荧光类似物不能用于GFP细胞或者FITC标记抗体的应用中。VFSE染料与CFSE功能相似，因为它们都包含酯酶切割和胺反应的SE基团。VFSE染料能用于多色反应，因为VFSE与CFSE和它的荧光类似物具有不一样的激发和发射光谱， 因此可以用于GFP转染细胞或者FITC标记抗体的应用中。
DiI(细胞膜红色荧光探针)
DiI即DiIC18(3)，全称为1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光。DiI是一种亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。
DiI在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。DiI被激发后可以发出橙红色的荧光，DiI和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱参考下图。其中，最大激发波长为549nm，最大发射波长为565nm。
DiI的分子式为C59H97ClN2O4，分子量为933.88，CAS number为41085-99-8。
DiI可以溶解于无水乙醇、DMSO和DMF，溶解度约为1-2.5mg/ml。发现较难溶解时可以适当加热，并用超声处理以促进溶解。
DiI被广泛用于正向或逆向的，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂(long-term tracer)。DiI通常不会影响细胞的生存力(viability)。被DiI标记的神经细胞在体外培养的条件下可以存活长达4周，在体内可以长达一年。DiI在经过固定的神经元细胞膜上的迁移速率为0.2-0.6mm/day，在活的神经元细胞膜上的的迁移速率为6mm/day。
DiI除了最简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移，通过FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)检测脂在细胞膜上的扩散，检测细胞毒性和标记脂蛋白等。
用于细胞膜荧光标记时，DiI的常用浓度为1-25μM，最常用的浓度为5-10μM。DiI可以直接染色活的细胞或组织，染色时间通常为5-20分钟。对于固定的细胞或组织，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛进行固定，使用其它不适当的固定液会导致荧光背景较高。
篇三：HRP束路示踪法
HRP束路示踪法
HRP束路示踪法的基本步骤是将HRP注射至中枢神经系统或周围器官、神经的一定部位，经过一定时间后灌流固定动物，取材制作冰冻切片，然后用过氧化氢及呈色剂来显示HRP标记。具体就是[吕国蔚. 实验神经生物学. 北京：科学出版社，2002. 108~241]，将HRP配成20～50%的水溶液或盐水溶液，用微量注射器注入脑的某一部位。一定时间后，HRP随即被神经末梢通过非特异性整体胞饮（bulk endocytosis）的方式摄入，逆向运至胞体。然后用组织化学方法显示HRP的运输结果。HRP反应原理是H2O2和显色液（本质上是氢供体）TMB或者DAB在HRP作用下发生氧化还原反应生成棕褐色或者蓝黑色物质用于标记神经元。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。DAB具有致癌性，但是反应生成的标记物质较为稳定，TMB相比DAB更灵敏，但是生成的标记物质不耐长久保存。两者各有优缺点，实验显色液采用TMB。
1、材料和方法
1.1、实验动物
健康成年鲤鱼，购自秦皇岛水产市场，实验前饲养1周以适应环境。
1.2、实验试剂与仪器
已有：丁香酚、固定液（4%多聚甲醛+1.25%戊二醛）、磷酸缓冲液(PBS)、无水乙醇、透明剂（乙醇二甲苯溶液体积比1：1，二甲苯）、粘片剂、封片剂、生理盐水、环氧树脂、EVA（乙烯-醋酸乙烯共聚物）热熔胶、1号针灸针（直径0.16mm，苏州医疗用品厂有限公司）、微型手电钻（型号：P-600，慈溪市宝和工具有限公司）、模具电磨（型号：7002，永康市喜克莱工具有限公司）、台式动物手术显微镜（型号：77001，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）、导线。
未有：辣根过氧化物酶（20%辣根过氧化物酶，PBS 配制）、显色液（四甲基联苯胺，TMB）、醋酸缓冲液（5.1g乙酸钠+20ml冰乙酸+230ml去离子水，用醋酸或NaOH 调整PH值到3.3）、染色剂[1% neutral red(南京基元生物技术有限公司)solution，去离子水配制，然后用冰醋酸滴定至PH值至7]、立体定位仪、微量注射装置、生物数码显微镜（Motic B.Moticam 1300）、
名称：TJ-3A/W0109-1B单通道精密注射泵
型号：TJ-3A/W0109-1B
品牌：保定兰格
类别：微量注射泵
辣根过氧化物酶（HRP)：产品编号390011-H、价格150.00元、包装10mg、厂家北京赛驰生物科技有限公司。
3,3’5,5’-四甲基联苯胺二盐酸：产品编号380002-T、价格65.00元、包装100mg、厂家北京赛驰生物科技有限公司。
2实验方法
2.1、麻醉
将丁香酚：无水乙醇：水按1：8：6000的比例混合摇匀，配制成0.48 g/L的丁香酚溶液，将鲤鱼放置在配好的丁香酚麻醉液中（100s±5s），待其兴奋性基本消失，鳃盖扇动偶有出现，鱼鳍偶有摆动，翻正反射基本消失，侧卧水底即麻醉三期时，将其固定在手术台上，准备进行开颅手术。
2.2、开颅手术
将麻醉好的鲤鱼固定于手术台，按照鲤鱼脑立体定位方法，利用设计的专用头部夹持装置，将鲤鱼头部固定在脑立体定位仪上。用模具电磨在鲤鱼脑组织上方的颅盖骨上打开一个3cm*2cm的切口，在体视显微镜下用棉签剥去脑腔中的脑脊液，使脑充分暴露在视线内。实验应注意及时用沾有生理盐水的药棉给鲤鱼保湿，避免皮肤和组织干燥。以鲤鱼颅骨表面囟点为定位基准点(原点)，运用定位仪上的三维游标尺，确定脑区HRP注射位点在立体定位仪上的三维坐标。
2.3、HRP注射
鲤鱼开颅手术确定注射位点后，进行HRP注射：
⑴将微量注射装置固定于立体定位仪上；
⑵吸取0.3μl的20%辣根过氧化物酶溶液；
⑶注射位点：在鲤鱼行为控制试验中的控制其动作的脑区高频位点进行注入。20～30min完成注射。注射完毕，将玻璃微管停留脑内30min，使辣根过氧化物酶完全扩散到注射位点周围脑组织中，然后匀速取出
2.4、术后处理
2.4.1、封闭颅骨及饲养
实验结束，封闭颅骨，放回鱼池饲养。
2.4.2、组织样本制作
动物存活50小时后，大剂量麻醉，灌流固定（打开体腔暴露心脏，从颈总动脉速灌温热0.8%生理盐水150ml冲血，待流出液无色后缓慢灌流4%多聚甲醛+1.25%戊二醛固定液150ml）后，取脑放入4%多聚甲醛+1.25%戊二醛的混合液中后固定。第二天进行冠状冰冻切片（片厚30μm）。
2.5、切片处理
切制好的冰冻切片按下述步骤处理：
⑴脑组织切片在磷酸缓冲液中漂洗3次，每次10-15min；
⑵将切片放入未加H2O2的孵育液中孵育20-30 min（19-30℃）；
⑶向孵育液中加入H2O2（每100ml孵育液中加入0.3% H2O21-5ml）孵育20-30min；
⑷用磷酸缓冲液漂洗3次，每次10-15min，漂洗后的组织切片稍微晾干准备复染。
⑸复染采用中性红染色，在1%的中性红染液中染色2-5min，然后梯度乙醇脱水、二甲苯透明最后中性树胶封片保存。
其中，孵育液由A液和B液混合而成：A液，取PH值3.3的醋酸缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加92.5ml去离子水混合；B液，取5mgTMB加入到
2.5ml的无水乙醇中，在恒温水浴锅中加热至38℃使TMB完全溶解。注意，因为孵育液不能长时间保存，应在放入标本前将A液和B液混合。
2.6、镜检分析
切片干燥后，在显微镜下镜检观察拍照，确定注射位点以及标记的胞体和纤维。注意，标记的纤维和胞体呈黑色（TMB和H2O2在HRP作用下生成不溶性的吩嗪类物质，呈蓝黑色，有时也会呈现棕色）。
另外，在显微镜下可以看到有的区域存在杂质或者假阳性标记，可能是漂洗不充分造成的，可以在高倍镜下对阳性标记和假阳性标记进行区分。
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