篇一：网管员世界-ARP病毒的检测方法
ARP 病毒的检测方法
ARP 病毒的检测方法
方法一，用户自查法
1. 同时按住键盘上的―Ctrl+ Alt+Del‖键，选择―任务管理器‖，单击―进程‖标签，查看其中是
否有一个名为―MIR0.dat‖进程。如果有，说明已经中毒。右键点击此进程后, 选择―结束进程‖ 命令。
2. 如果用户突然发现无法上网，可以通过如下方法验证是否感染此木马病毒：
（1）单击―开始→运行‖，输入―cmd‖，再输入―arp-d‖，回车。
（2）重新尝试上网，若能短暂正常访问，则说明此次断网是受木马病毒影响。该病毒发作 后，在系统进程列表中会有―MIR0.dat‖这个进程存在，可通过直接结束进程的方法解决。 方法二，基层定位法
1. 因所有基层单位都是通过三层交换机设备接入城域网的，因此可以通过检查其三层交换 机设备上的ARP 表来进行定位。
如果发现有多个IP 地址对应同一个MAC 地址，则说明此MAC 地址对应的计算机很可能
中了ARP 木马病毒。可通过下连的二层交换机的转发表查到此MAC 地址对应的交换机端
口，从而定位出有问题的计算机，关闭此端口，通知终端用户查杀病毒结束后再开放端口。 2. 让基层单位网络管理员扫描本子网内的全部IP 地址，然后再查ARP 表。如果有一个IP 地址对应的MAC 地址与网关的 MAC 地址相同，那么这个 IP 地址和 MAC地址就是中毒
计算机的IP 地址和 MAC 地址。
方法三, 端口镜像抓包分析法
笔者所在的教育城域网通过NAT 转换的方式连接到互联网，所以在中心交换机上将内网口 进行了端口镜像，利用 Sniffer 进行抓包分析，凡大量发送 ARP 请求的均可能是此木马感
染者。
一经发现，立即关闭此端口，并通过交换端口确定上网用户，通知用户查杀病毒，直至确认 无毒后再开放端口。
处理方案
1. 静态ARP 绑定网关
步骤一：
在能正常上网时，进入MS-DOS 窗口，输入命令―arp-a‖，查看网关IP 对应的正确MAC 地 址，并将其记录下来。 如果已经不能上网，则先运行一次命令arp -d, 将arp 缓存中的内容清空，计算机可暂时恢 复上网（攻击如果不停止的话）。一旦能够上网，就立即将网络断掉（禁用网卡或拔掉网线），
再运行―arp -a‖命令。
步骤二：
如果计算机已经有网关的正确 MAC 地址，在不能上网时，只需手工将网关 IP 和正确的
MAC 地址绑定，即可确保计算机不再遭到欺骗攻击。
要想手工绑定，可在MS-DOS 窗口下运行以下命令：arp － s 网关IP 网关MAC
假设计算机所处网段的网关为10.8.6.250，本机地址为10.8.6.9，在计算机上运行―arp － a‖ 后输出如下内容：
????C:Documents and Settings>arp -a
????Interface:10.8.6.9 -- 0x2
????Internet Address Physical Address
????Type
????10.8.6.250 00-01-02- 03-04-05 dynamic
其中，00-01-02-03-04-05 就是网关10.8.6.250 对应的 MAC 地址，类型是动态dynamic，因
此是可被改变的。
被攻击后，再用该命令查看，就会发现该MAC 地址已经被替换成攻击机器的 MAC 地址。 如果希望找出攻击机器，彻底根除攻击，可以将该MAC 记录下来，为以后查找该攻击的机
器做准备。
手工绑定的命令为：
????arp－s 10.8.6.250 00-01 -02-03-04-05
绑定完，可以再用―arp -a‖查看arp 缓存：
?? C:Documents and Settings >arp -a
?? Interface:10.8.6.9 -- 0x2
?? Internet Address Physical Address Type
??? 10.8.6.250 00-01-02- 03-04-05 static
这时，类型变为静态（static），就不会再受攻击影响了。
需要说明的是，手工绑定在计算机关机重启后就会失效，需要再次重新绑定。所以，要彻底 根除攻击，只有找出网段内被 ARP 病毒感染的计算机，把病毒杀掉，才算是真正解决问题。
2. 制作批处理文件
在客户端做对网关的arp 绑定，具体操作步骤如下。
步骤一：
查找本网段的网关地址，比如192.168.1.1，以下以此网关为例。在正常上网时，单击―开始 →运行→ cmd →确定‖，输入：arp -a，点回车，查看网关对应的PhysicalAddress。
比如：网关192.168.1.1 对应00-01-02-03-04-05。
步骤二：
编写一个批处理文件rarp.bat，内容如下：
????@echo off
????arp －d
????arp -s 192.168.1.1 00－01－02－03－
????04－05
保存为rarp.bat。
步骤三：
运行批处理文件将这个批处理文件拖到―Windows‖→―开始‖→―程序‖→―启动‖中，如果需要
立即生效，请运行此文件。
以上配置需要在网络正常时进行。
3. 利用安全工具软件
及时下载Anti ARP Sniffer 软件保护本地计算机的正常运行。具体使用方法可在网上搜索。
如果已有病毒计算机的 MAC 地址，可使用 NBTSCAN 等软件找出网段内与该 MAC 地址
对应的IP，即感染病毒的计算机的IP 地址，然后报告给网络管理员，对其进行查封，或者 利用单位提供的集中网络防病毒系统来统一查杀木马。另外，还可以利用木马杀客等安全工
具进行查杀。
预防和注意事项
预防ARP 欺骗木马病毒的最根本的措施其实还是老生常谈的那几项：定期更新操作系统；
下载和安装最新的系统补丁；安装杀毒软件并及时升级病毒库；提高上网用户的网络安全防 范意识和能力等。
笔者在这里要特别强调一下，一定要努力提高上网用户的网络安全防范意识和水平。要知道， 网络安全问题不是网络中心一个部门就能解决的，需要所有上网 用户的配合和支持。因为 蠕虫、病毒和木马等在网络中的传播速度越来越快，任何一个用户受到病毒感染，都可能给
整个网络带来致命的影响。
应该通过培训和讲座提高用户的网络安全防范意识和能力，提高整体的防毒意识。只有大家 共同努力，才可能营造一个稳定、安全、畅通的网络环境。
警惕内部人员威胁
病毒和黑客攻击往往能给人们带来直接而明确的损失或影响，因此，很多企业特别是中小企 业对于安全的认识还停留在防范病毒和黑客攻击上。然而，随着企 业信息化的发展，存储
在IT 系统中的数据的安全问题开始凸显出来，但很多企业对于企业核心数据损失及泄露这 一问题却不够重视，甚至个别企业并没有把数据损失及泄露视为安全问题，没有 采取任何
有效的防范措施。
事实上，每个企业在自身运作过程中都会产生大量的数据，其中有很多都具有极大的价值， 需要进行重点保护。而从实际案例来看, 企业所面临的数据损失及泄露方面的风险可能比病 毒和黑客攻击的风险更大。如果企业不能清楚地认识到其中存在的风险，缺乏相应的控制和
防范手段，那么一旦出 现重大的数据损失及泄露事件，必然会给企业带来巨大的经济损失
和负面影响。
导致数据损失及泄露的威胁来源有很多，比如黑客、竞争对手、商业间谍等，但最为普遍的 是来自企业内部人员的风险。
许多企业只重视来自外部的威胁，并积极主动地进行防范，但对于来自内部人员的威胁却知
之甚少，这就导致数据保护策略存在很大的漏洞，大大增加了数据损失的风险。企业如果想 要有效地解决数据损失及泄露问题，就必须清楚地认识并评估来自企业内部人员的各种威 胁。
尽管由于业务的不同，每个企业在数据保护方面所面临的具体威胁是有差异的，但其中依然 存在共同和普遍性的威胁。
下面笔者就列举和分析一下企业中最为典型和常见的内部威胁场景。
离职员工的“小动作”
在企业中，正常与非正常的人员流动是不可避免的，很多员工在离职之前都或多或少地接触 和掌握了一些企业的敏感数据。当这些员工准备离职时，他们中的 一些人有可能为了在以
后的工作中有所―参考‖，或者为了将来更好地展示自己的能力和价值，偷窃公司中将来可能 会用到的数据，比如销售渠道信息、客户信息、 最新产品资料、设计方案、技术文档、源 代码、软件授权等。
在很多案例中，离职员工在离职的最后几天都会做出一些―小动作‖，这些―小动作‖可能是偷
窃公司的敏感数据，也可能对公司的数据进行破坏。
其中，偷窃数据的行为比较常见，很多离职员工都会从办公电脑、公司文件服务器或公司内 网系统中取得他们想要的数据资料，然后通过各种方式将这些敏感 数据带走。例如，把数
据复制到移动硬盘、U 盘、刻录光盘、手机等存储介质中，随手带走；通过QQ、MSN 等 IM 工具的文件传输功能外传数据；把数据上传到网络硬盘等在线存储中；用 E-mail 发送
数据；打印或复印重要资料；对资料进行拍照等。
除了偷窃数据外，有些恶意的离职员工甚至还有可能删除或修改企业的敏感数据，或者在其 中植入木马、后门等。
离职员工的这些小动作给企业带来的后果可能是非常严重的：一些产品设计可能被抄袭模 仿，重要客户可能流失，原有的竞争优势可能莫名其妙地失去，企业收入可能受到影响，客 户信息可能被泄露，还有可能给企业带来法律上的处罚等。
为了防范离职员工的这些小动作，企业需要针对性地
采取一些数据保护措施：
（1）在不违反法律的前提下，对员工的活动进行监控，以便及时发现用户操作中的有害行 为。
（2）监控敏感数据的使用。
（3）建立强有力的取证体系，即便泄密也有办法进行调查取证。
（4）改进员工离职流程，加强管理监督。
掌握敏感数据员工的违规操作
篇二：四种传统病毒检测算法
传统的病毒检测算法主要有特征代码法、校验和法、行为监测法、软件模拟法等。
1.特征代码法
特征代码法几乎被所有的著名病毒检测厂商所采用，防毒软件将所有病毒的病毒码加以剖析，并且将这些病毒独有的特征搜集在一个病毒码资料库中，杀毒软件程序扫描时与病毒码资料库内的现有资料一一比对，如果两方资料皆有吻合之处的话，既判定该程序已遭病毒感染。采用病毒特征代码法检测准确，但不能用来检测未知恶意代码。
2.校验和法
病毒大都依附或寄生于其它的程序中，所以被感染的程序会有文件大小增加的情况产生或者是文件日期被修改的情形。防毒软件在安装的时候会自动将硬盘中的所有文件资料做一次汇总并加以记录，将正常文件的内容计算校验和，并写入文件保存。定期地检查文件现在内容算出的校验和与原来保存的校验和是否一致，因而可以发现文件是否感染，这种方法叫校验和法，它既可发现已知病毒又可发现未知病毒。
3.行为监测法
利用病毒的特有行为特征性来监测病毒的方法，称为行为监测法。通过对病毒多年的观察、研究，有一些行为是病毒的共同行为，而且比较特殊。在正常程序中，这些行为比较罕见。当程序运行时，监视其行为。行为监测法可发现未知病毒、但它不能识别病毒名称。
4.软件模拟法
多态性病毒每次感染都变化其病毒密码，对付这种病毒，特征代码法失效。因为多态性病毒代码实施密码化，而且每次所用密钥不同，把染毒的病毒代码相互比较也各不相同，因此，出现了一种新的病毒监测方法，那就是软件模拟法。该类工具开始使用特征代码法监测病毒，如果发现隐蔽病毒或多态性病毒嫌疑时，启动软件模拟模块，监测病毒的运行，待病毒自身的密码译码后，再运用特征代码法来识别病毒的种类。
篇三：植物的病毒检测技术
植物的病毒检测技术
植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法
1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA)
酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、
[1]伏安酶联免疫分析 、快速ELISA 等。
1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA)
快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达5ng/ml～50ng/ml 。
1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say)
免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。
随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
易快速的胶体金免疫层析试验( Gold immuno-chromatography assay) ,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔膜的毛细管作用,使滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗透移动,在移动的过程中,抗体抗原发生反应,并通过免疫金的颜色显示出来。上述两种快速检测技术的优点是简便、快速、直接,不需要酶促反应底物,除试剂外不需任何特殊仪器设备,特别适于田间快速诊断和口岸检疫。但不能准确定量,灵敏度与酶联相当。魏梅生等[5～6] 应用该技术成功地进行烟草环斑病毒的检测。
1．4 免疫毛细管区带电泳( Immuno-capillary zone electrophoresis , I-CZE)
毛细管区带电泳是在装有一种电解液的空毛细管两端加一个外加电压。在外加电压作用下,通过电泳迁移和电渗流的作用,样品中的不同组分由于迁移率的不同而分开。I-CZE将血清学反应专化性和毛细管区带电泳灵敏、快速、可自动检测的特点结合起来,实时检测抗原- 抗体复合体Eun[7 ] 等应用I-CZE检测到10fg 建兰花叶病毒和齿兰环班病毒的提纯病毒。I-CZE 灵敏度高,且可快速分析多个样品,因而在无病毒苗木检测、抗病品种选育、植物检疫、种质筛选等方面可发挥巨大作用,有广阔的应用前景。
1．5 免疫PCR
近年来出现的免疫PCR 是一种将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高灵敏度有机结合的检测技术,与酶联检测技术相比,免疫PCR 是先用抗体来捕获抗原,提取核酸后,再用PCR 扩增DNA 片段,从而放大抗原抗体反应,大大提高了检测灵敏度。Sharman[8]建立的复合免疫PCR ,可同时检测香蕉和车前草粗提液中的香蕉苞叶花叶病毒、黄瓜花叶病毒和香蕉束顶病毒。
1.6 沉淀法
在电解质存在时，抗体与同源抗原相互结合形成沉淀，不同病毒类型形成沉淀也不同。如杆状、线状病毒形成絮状沉淀，球形病毒多形成颗粒状沉淀，通过稀释终点法，就是利用稀释终点对于每种病毒来说是比较稳定的这一特点，来测定病毒溶度。
1.7 补体结合测定法
血清中有一种对热不稳定的成分，它能在抗体存在的条件下，溶解红血球或破坏革兰氏阴性菌，这种成分称为补体。它的一个重要特性是一旦抗体与抗原结合，则补体也与之结合，通过补体的酶作用可以溶解红细胞。
2 以病毒核酸为基础的检测方法
2．1 多聚酶链式反应(PCR)
PCR 是Mullis 等在1985 年发明的一种特异性DNA 体外扩增技术。其基本原理是:以待扩增的DNA 样品为模板,两个分别与待扩增DNA 片断正链和负链互补的DNA 片断为引物,在DNA 聚合酶的催化下,快速体外扩增特异DNA 序列。在反应过程中,前一轮扩增得到的DNA 又作为后一轮反应的模板,因此DNA 的量迅速增加,一般经过大约30次循环反应,DNA 的量可扩增100 万倍以上。对于DNA 病毒可以直接进行扩增,而对于大多数的RNA 病毒,则需先将RNA反转录成cDNA 再进行PCR 扩增, 此方法称RT2PCR(Reverse transcription-PCR) 。用PCR 检测植物病毒所需时间短,灵敏度特别高。用RT2PCR 检测苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的灵敏度可达5pg[10]。近年来,在此基础上又发展了多种方法用于植物病毒检测。如复合PT2PCR 是在同一RT-PCR 反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段;PCR-ELISA 是用
ELISA代替琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,灵敏度高。Olmos 等用PCR2ELISA 方法检测李痘病毒的灵敏度比免疫PCR 高100 倍。
2．2 分子信标(Molecular beacon)
分子信标[13 ] 是具有茎环结构的一段单链核酸分子,5′- 端和3′- 端序列互补形成“茎”,与目标序列互补的探针序列为“环”,在5′- 端连接荧光组分,3′- 端连接猝灭组分。反应开始时先将反应液加热到80 ℃,这时分子信标变性,无茎环结构,不管有无目标序列均有荧光。当温度逐渐降到20 ℃时,连续检测其荧光强度。如果反应中产生与分子信标互补的目标序列,当温度降到解链温度时,分子信标和目标序列杂交,荧光部分从猝灭部分移开,从而发出荧光。如果反应中没有目标序列,分子信标的两臂相遇形成茎环结构,不会产生荧光。由于只有与互补序列杂交后分子信标才发出荧光,未杂交的信标不发荧光,因此不需要从反应混合物中除去未杂交的分子信标,可实时定量检测,灵敏度高。
2．3 TaqMan实时定量PCR ( Real-time RT-PCR)
TaqMan实时定量PCR 是将RT-PCR和荧光检测相结合,利用TaqDNA 聚合酶的5′-端核酸酶活性来切割在扩增过程中与目标序列退火的荧光探针。探针5′- 端连接荧光组分,3′- 端连接猝灭组分,当探针完整时,无荧光出现。在PCR 过程中,荧光探针(也称TaqMan探针) 专化性地与两引物扩增产物间的一段序列退火后被TaqDNA 聚合酶切割,荧光组分与猝灭组分分开,产生荧光信号,荧光信号的强度与目标序列浓度或拷贝数成比例。在每一循环中,都会有更多的分子被切割下来,荧光强度呈指数增长。TaqMan实时RT-PCR不仅可避免假阳性的出现、提高检测灵敏度、实时定量检测,并且可在一个反应管内完成,减少了污染,反应自动完成, 易定量。应用该技术, Roberts等[14]成功检测少至500fg 的番茄斑萎病毒,Eun 等[15] 同时检测少至5fg 的建兰花叶病毒和齿兰环班病毒。
2．4 核酸杂交技术(Nucleic acid hybridization)
核酸杂交是两段具有一定的同源性、来源不同的核酸分子在去掉变性条件后,互补的区段退火形成异质双链分子的过程。核酸杂交是先将待测核酸固定在膜上,然后用核酸探针与其进行杂交,使杂交体带上标记而被显示出来。一般采用核酸点杂交法来检测植物病毒,直接把病毒核酸点到NC 膜上再使之与探针杂交;也有的直接把病毒样品点到NC膜上。检测的专化性程度取决于探针与病毒核酸序列的互补程度。核酸杂交技术适用于DNA 病毒、RNA 病毒及类病毒的检测,灵敏度高、特异性强,可检测到1pg 的DNA。朱水芳等[16] 、李尉民等[17]分别应用核酸杂交成功检测了番茄环斑病毒和南方菜豆花叶病毒。核酸杂交还可和RT-PCR 结合使用,Bertolini 等[18] 采用复合RT-PCR 同时检测侵染橄揽树的6 种RNA 病毒,随后用这6 种病毒的特异Dig(地高辛) 标记的探针对PCR 产物进行检测。Dig 标记的cRNA 探针检测马铃薯卷叶病毒的灵敏度可达1pg/ml 。
2．5 双链RNA分析(Double-stranded RNA ,dsRNA)
RNA 病毒、类病毒以及卫星RNA 在基因组复制过程中要形成双链的复制型或复制中间体,因此寄主植物体内存在其dsRNA ,且每一种RNA 病毒、类病毒、卫星RNA 形成的dsRNA 都是特异的,有各自的迁移率、分子量、片段数。但正常的植物组织中无大分子的dsRNA ,因而可以利用dsRNA进行RNA 病毒、类病毒和卫星RNA 的诊断与检测。dsRNA分析不需要贵重的仪器设备,在一般实验室即可进行。但不适合大量样品[12]
的检测,而且需要一定的技术和知识才能准确进行诊断。另外,本方法也不适合DNA 病毒的检测,在负链RNA 病毒如Rhabdovirus 侵染的植物组织中也未发现dsRNA。 3 其它检测方法
3．1 石英晶体微天平生物传感器(Quartz crystal microbalance biosensor)
石英晶体微天平生物传感器是由生物敏感元件(分子识别元件) 和传感器组成的分析仪器。生物敏感元件的活性材料可以是抗体或单链核酸,它们可与相应的病毒或病毒核酸特异识别。传感器把识别反应所引起的物理的、化学的变化转变成可直接测量的光信号或电信号。利用生物传感器可以实现对病毒的在线实时检测,灵敏度高、特异性强。在一定的线性范围内可分析专一物质的含量,但不能进行精确的病毒含量测定,主要用于定性分析。Eun 等[20～21]应用该技术进行两种兰花病毒的检测。
3．2 液相色谱-质谱分析和激光解吸-离子化质谱分析法
对于已知外壳蛋白分子量的病毒,可用液相色谱- 质谱分析法( liquid
chromatogram-phyPmass spectrometry , LCPMS) 和激光解吸-离子化质谱分析法(matrix-assisted laser des-orption-ionization mass spectrometry ,
MALDI-mass spectrometry) 来检测。该方法可快速、精确、灵敏地提供样品分子量信息。测定一个样品只需1g 病组织,制备方法简便,可自动检测大量样品[22]。
3.3 枯斑和指示植物检测法
利用受病毒侵染能产生枯斑的寄主植物进行检测病毒，用感染植物的叶片与少许金刚砂相混，研磨成粗汁液，然后在指示植物的叶片上蘸取汁液，摩擦供试植物的叶片，经清水清洗后，置于室温条件下的温室内测定，2-3d后叶片上会出现局部坏死灶，即圆形的枯斑，一定范围内，枯斑数与侵染病毒的溶度成正比。
3.4 电镜负染检测法
一些重金属离子能绕核蛋白体四周沉淀下来，形成一个黑暗的背景，在核蛋白体内部不能沉积而形成一个清晰的亮区，其图像如同一张照相的底片，称为负染色。
3.5免疫电镜检测法
是将免疫学原理与电镜负染技术相结合的产物，利用抗原抗体的亲和性和吸附性这一特点，使病毒能较集中地沉集在有效视野内，便于电镜下观察，大大提高了检测几率。
3.6电镜超薄切片法
该技术的发展已经达到病毒的体内定位研究和体内复制及侵染过程的动态研究水平，并能直观病毒生物大分子的亚基单位，已经从细胞水平发展到分子水平。尤其对一些未知病毒，难于提纯的病毒材料，负染技术不能解决的检测材料都可用此方法，通过对组织细胞的直接观察而得到解决，因此在病毒学检测和脱毒快繁的实际生产中均有着特殊的重要性和不可取代的作用。
4 已应用于兰花病毒检测的技术
4. 1 症状观察
症状观察是诊断兰花病毒病的传统方法之一, 但由于兰花品种多, 症状不稳定, 并有隐症现象, 栽培环境对症状表现也有一定影响。因此, 一般认为, 症状对诊断的意义不大,只能作为参考数据。有人曾从75 株外表不显症状的建兰植株中检出7 例ORSV , 从15 株表面健康的卡特兰中检出6 株感染Cym2MV , 2 株同时感染CymMV 和ORSV。
4. 2 生物学鉴定
生物学鉴定是一种十分准确和可靠的方法, 兰花病毒的鉴别寄主有苋色藜、望江南、千日红、曼陀罗以及Xanthi-nc 烟等。值得注意的是: 不同病毒和不同寄主, 需采用一些特殊的接种措施才能成功。如有的病毒(O FV )接种时需高温环境, 有的则需冷冻后研磨, 有的可用刀片切割病叶表皮后直接将汁液进行摩接。另外, 接种后症状表现的时间及持续技术也有很大区别, 如将CymMV 接种到苋色藜上需20～ 24 天后才表现症状, 而接种建兰环斑病毒则只需2～ 4 天就可表现症状。
4. 3 电镜检测
像CymMV 和ORSV 等一些病毒的粒子很常见, 它们为丝状体和杆状体, 电镜观察十分方便, 因此, 采用电镜或免疫吸附电镜直接观察病毒粒子是最快速的检测方法之一。
4. 4 血清学方法
目前, 血清学方法是国内外检测兰花病毒的常用方法, 除了琼脂双扩散、微量凝集法、对流免疫及EL ISA 外, 近年还发展了一些新的血清学方法。如采用致敏抗体(A 蛋白) 代替常规抗血清所形成的微量凝聚法, 其灵敏度就有很大的提高[23]。Kaw ano 等研制了一种新的致敏乳胶检测技术, 其是用不同颜色乳胶粒体代替常规乳胶, 根据滤纸上的乳胶和病毒粒体的毛细管作用原理, 不同结合产物颜色差异很大, 以此提高这一方法的灵敏度。不过, Ellio t t 在运用免疫双扩散、ELISA 及斑点免疫法检测大量样品后认为:不能依据一种血清学检测结果来判断样品是否带毒, 必须有两种以上方法相互印证后, 诊断结果才可靠[24]。
4. 5 核酸检测
Ch ia 应用组织印迹杂交技术检测建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒, 其主要步骤包括:横切兰花叶片, 将其表面印迹在硝酸纤维膜上, 然后使膜上核酸与经放射性标记处理的CymMV 和ORSV 的cDNAs杂交, 再采用自动放射显影术检测病毒粒子的存在情况。其灵敏度可达20pg, 较ELISA 方法灵敏2～3 个反应级[25]。
4. 6 PCR
分子生物学方法是近10多年来发展起来的一种新方法, 它以PCR技术为基础, 直接对病毒的核酸序列进行检测, 所以灵敏度较前述方法均有很大程度的提高。KiHyun 等研究了使用RT-PCR 检测CymMV 的方法,即以该病毒衣壳病毒基因作为引物模板, 合成一个由20个碱基对组成的引物, 然后对病毒核苷酸进行扩增, 扩增产物的长度为692bp。以反应体系中是否产生这种扩增产物来判断样品中是否存在该病毒。这种方法的灵敏度可达10fg, 所需样品量少, 在快速检测低含量样品时十分有用。
4.7 电化学发光反转录聚合酶链式反应技术
将反转录PCR技术与电化学发光分析方法结合起来,用于检测兰花中齿兰环斑病毒。检测过程中采用生物素标记的探针与PCR产物杂交,可起到筛选特异性产物的作用,从而避免假阳性结果的产生。三联吡啶钌标记探针与PCR产物杂交,既可以起到进一步筛选目的片段的作用,又可与分析液中的三丙胺反应,从而产生光信号,被电化学发光仪所检测到。在引物的5′端分别连接一段特异性核酸序列,既提高了钌探针与特异性产物的杂交几率,又增强了样品检测信号,从而提高了信躁比。实验结果表明:此方法灵敏度高、稳定性好、操作简单,可以从兰花样品中准确地检测到齿兰环
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